不受控制的增殖，腫瘤細胞的一大特點，通常是由細胞周期調控的故障，如蛋白激酶觸發。最近，細胞周期相關蛋白激酶已成為有吸引力的目標為抗癌治療，因為它們在細胞增殖基本作用。然而，迄今已開發的蛋白激酶靶向藥物不顯示令人印象深刻的臨床結果也顯示嚴重的副作用;因此，存在無疑需要研究新藥物靶向其它蛋白激酶是在細胞周期進程至關重要。牛痘相關激酶1（VRK1）是在細胞周期調控的功能通過磷酸化細胞周期相關基材如阻擋到自動積分因子（BAF），組蛋白H3和cAMP反應元件（CRE）結合有絲分裂激酶蛋白（CREB）。在我們的研究中，我們通過篩選小分子天然複合文庫中木犀草素為VRK1的抑制劑。這裡，我們評估木犀草素的功效作為開發一種有效的抗癌策略VRK1靶向抑制劑。我們證實，木犀草素顯著降低了細胞周期相關基材BAF和組蛋白H3的VRK1介導的磷酸化，並直接與VRK1的催化結構域相互作用。此外，木犀草素通過調製VRK1的活性，導致癌細胞增殖的抑制和凋亡的誘導調節細胞周期進程。因此，我們的研究表明，木犀草素誘導VRK1抑制可能有助於建立抗癌治療的新的細胞周期靶向策略。
引文：金YS，金S-H，信Ĵ，Harikishore A，林J-K，鄭Y，等人。 e109655：（2014）通過靶向牛痘相關激酶1公共科學圖書館·ONE 9（10）木犀草素抑制癌細胞增殖的影響。 DOI：10.1371 / journal.pone.0109655
編輯：A. R. M. Ruhul阿明，埃默里大學的溫希普癌症研究所，美國
收稿日期：2014年4月24日;受理：2014年9月2日;發布時間：2014年10月13日
版權所有：©2014 Kim等人。這是在Creative Commons署名許可，允許在任何媒體不受限制地使用，分配和繁殖的條件分布的開放式訪問文章中，提供的原始作者和出處記。
數據可用性：作者確認潛在結果的所有數據完全不加限制。所有培訓相關數據是紙和其Suppoting信息文件內。
資金來源：這項工作是由韓國國家研究基金會（NRF）（2013-056085）資助項目，下一代BioGreen 21計劃（第PJ009503），農村振興廳，韓國。這項工作也是由教育，科學和技術的韓國部腦韓國21項目的支持。該資助者在研究設計，數據收集和分析，決定發表或準備手稿沒有作用。
競爭利益：作者聲明，沒有競爭的利益存在。
介紹
腫瘤發生與細胞分裂，這通常是由缺陷蛋白調節劑，在細胞周期關卡和進展[1]中發揮關鍵作用的調節觸發的失調相關。之間構成細胞周期機械蛋白質，最近的治療策略已經嘗試採取指定幾個細胞周期蛋白激酶的優勢，以提高藥物的選擇性和治療有效性[2]，[3]。因此，這樣的細胞周期相關蛋白激酶已成為有吸引力的目標為抗癌治療，由於其基本功能在控制細胞生長。例如，該DNA損傷檢查點的蛋白清潔香港1和2的小分子抑制劑用相間過程中引起的細胞周期停滯和細胞凋亡的意圖使用[4] - [6]。此外，一些有絲分裂抑制劑靶向細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）家族，Aurora激酶，和Polo樣激酶已經開發了通過使在染色體縮合，染色體排列缺陷挑起透水進入有絲分裂，有絲分裂停滯，和有絲分裂災變，紡錘體形成，和主軸組件的檢查點[1] - [3]。對於幾個有前途的抑制劑，臨床試驗已進行了開發一類新的抗癌藥物。在臨床試驗階段，不幸的是，他們的臨床療效沒有顯示令人印象深刻的結果，而是引起有限的響應或者甚至意外嚴重副作用[3]。然而，細胞周期的某些階段的有效的抑制仍然被視為以治療癌症的有價值的策略，因此鑑定新穎的，細胞周期特異性的，成藥靶蛋白和它們的選擇性抑制劑的開發可能有潛力成為化學治療劑是無疑需要。
在這方面，我們研究了牛痘相關激酶1（VRK1）是否可能是根據細胞周期靶向策略的適當的分子靶點。 VRK1，其特異性地磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基，是有絲分裂激酶通過參與多種細胞分裂過程[7]的在細胞周期進程中起重要作用，[8]。 VRK1表達在高度增殖的細胞，如胎兒和腫瘤組織中特異性豐富，並且主要顯示期間在細胞周期[9]的有絲分裂期上調，[10]的傾向。在G1 / S期，VRK1促進細胞周期蛋白D1（CCND1）表達通過磷酸化cAMP反應元件（CRE）結合蛋白（CREB）和由此增強CREB的結合親和力的CCND1啟動子[11以誘導G1 / S期過渡]。此外，VRK1相間和有絲分裂進入/退出[12]在發生在核膜（NE）的動態，如NE組裝/拆卸通過的障礙到自動積分係數（BAF）的磷酸化的一部分。 BAF是一個染色質相關蛋白功能DNA和網元[13]之間的連結。 BAF細胞周期進程中的動態狀態緊緊VRK1活動監管; BAF磷酸化VRK1刺激從網元染色質釋放，和末期[12]中募集網元相關蛋白入芯區[14]。在有絲分裂期，VRK1通過磷酸化組蛋白H3 [10]影響組蛋白修飾。組蛋白H3 Ser10由VRK1和其他幾個有絲分裂激酶的磷酸化是一個眾所周知的組蛋白密碼在誘導進入有絲分裂或G2 / M期過渡染色質凝聚。在細胞周期，VRK1介導的組蛋白H3的磷酸化是由其它監管機構的影響。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶2（MKP2），雙特異性磷酸酶滅活MAP激酶（的MAPKs），發揮了作用於有絲分裂期[15] VRK1介導的組蛋白H3磷酸化的負調節劑。期間相間，宏組蛋白H2A1.2（MacroH2A1），一個核心組蛋白變體中，抑制VRK1的到組蛋白H3通過螯合[16]的方法。
此外，最近的研究還已經表明VRK1的細胞增殖過程中的重要性。 VRK1具有至關重要的作用，不僅在體細胞的增殖，而且在生殖細胞發育[17]，[18]。此外，VRK1也起著維持端粒通過磷酸核糖核蛋白A 1，刺激端粒酶並結合端粒DNA序列[19]的作用。 VRK1需要G0退出，高爾基碎片，DNA損傷誘導的細胞凋亡，和應激反應，這是必要的，以保持細胞周期進展[20] - [24]。因此，考慮VRK1的細胞周期相關特性，需要對抗癌療法VRK1抑制劑的鑑定。雖然有報導說，一些藥物抑制其他蛋白激酶可抑制VRK1的激酶活性[25]，通過抑制VRK1抑制機制和防癌作用仍難以捉摸。
在我們的研究中，我們篩選小分子的天然化合物文庫並確定木犀草素（3'，4'，5,7- tetrahydroxyflavone）作為小分子抑制VRK1激酶活性。木犀草素是一種天然存在的類黃酮是通常分布於植物和眾所周知充當有效的抗氧化劑[26]。在傳統的亞洲的補救措施，木犀草素豐富草藥已被用來作為傳統藥物用於治療許多疾病，如疼痛病症，炎性疾病，高血壓，和癌症[27]。今天，證據許多線已經證明木犀草素的許多藥理作用包括抗腫瘤，抗炎和抗過敏活性[27]，[28]。雖然已確定木犀草素的抗腫瘤特性與促凋亡效應，抗增殖作用，和血管生成和轉移的抑制有關，其抗癌活性的分子機制尚未完全確定[29] [30]。
在這裡，我們證實，木犀草素顯示顯著降低了細胞周期相關基材的組蛋白H3和BAF的磷酸化，並直接與VRK1相互作用，在其催化結構域特異性對接。此外，我們表明，木犀草素可能通過抑制VRK1激酶活性，導致癌細胞的生長和凋亡抑制細胞周期停滯。因此，我們建議，木犀草素是VRK1，這是很好的候選治療癌症的一種抑制劑。
材料和方法
化學品和試劑
木犀草素是分析純自Sigma-Aldrich（聖路易斯，密蘇里州，美國）。 Eupatilin和漢黃芩素是從BAEK博士在慶熙大學的實驗室提供。在DMSO（Sigma-Aldrich公司），製備這些化合物。 [32P-γ] ATP從珀金埃爾默/ NEN（沃爾瑟姆，MA，USA）和重組組蛋白H3購自羅氏應用科學（印第安納波利斯，IN，USA）購得。其它重組蛋白如穀胱甘肽磺酶（GST），GST-VRK1，GST-極光激酶B（AURKB）和His-BAF在大腸桿菌（BL21）中表達並通過親和層析純化。拉明B，甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和GST抗體來自Santa Cruz技術（Santa Cruz公司，CA，美國）和組蛋白H3磷酸化Ser10抗體購自Abcam公司（劍橋，英國）和那些對組蛋白H3被購買，磷酸化CREB及CREB購自Cell Signaling Technology公司（丹弗斯，MA，USA）獲得。 VRK1和磷酸-BAF（羅伯特克雷吉，美國國立衛生研究院的禮物，美國）在兔使用純化VRK1蛋白產生抗體。赫斯特33342從Sigma-Aldrich公司購買。溴化氰的Sepharose 4B是從Sigma-Aldrich公司購買。
細胞培養和轉染
從ATCC（馬納薩斯，維吉尼亞州）獲得BEAS-2B細胞。先前描述的HeLa [31]，HEK293A [16]，SH-SY5Y [32]，U2OS [32]，和A549 [31]在該研究中使用的細胞。人宮頸腺癌細胞系HeLa，人胚胎腎細胞系HEK293A，人支氣管上皮細胞系BEAS-2B和人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y中Dulbecco改良的Eagle培養基中生長補充有10％胎牛血清（DMEM）培養基血清和1％青黴素 - 鏈黴素。人類骨肉瘤細胞系U2OS和人肺腺癌細胞系A549中補充有10％胎牛血清和1％青黴素 - 鏈黴素的RPMI1640培養基中生長。這些細胞系在5％CO 2的潮濕氣氛中，保持在37℃。 HeLa和U2OS細胞的瞬時轉染進行了使用根據製造商的方案的MP-100微孔器（Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國）。
蛋白激酶測定
體外激酶測定是按照早先描述的方法進行[31]。簡而言之，在體外激酶測定在含有GST-VRK1，GST-AURKB，他-BAF，組蛋白H3和[32P-γ] ATP的激酶緩衝液中進行。激酶測定混合物在30℃下溫育30分鐘，並通過放射自顯影檢測到的放射性摻入。在激酶測定中使用的蛋白質的量通過使用硝酸銀（Sigma-Aldrich公司）或考馬斯藍（Sigma-Aldrich公司）進行測定。
細胞生存力測定法
細胞處理24小時或與類黃酮（木犀草素，eupatilin，和漢黃芩素）48小時或二甲基亞碸（DMSO）作為對照。細胞生存力根據製造商的方案使用3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-2,5- diphenyltetarazolium溴化物（MTT）法評估。使用GraphPad Prism（的GraphPad，聖地亞哥，CA，USA）測定的半數最大抑制濃度（IC 50）。
木犀草素瓊脂糖4B準備和體外pull-down實驗
瓊脂糖4B珠粉末懸浮在用於偶聯反應的活化溶液。活化的Sepharose 4B珠在偶聯溶液在4℃下溫育木犀草素在旋轉搖床上過夜。用於體外下拉測定法中，GST-VRK1和GST是在反應溶液與木犀草素 - 瓊脂糖4B珠溫育12小時。結合在珠蛋白通過免疫印跡進行分析。我們進行了哪些先前[33]中描述的詳細程序。
表面等離子體共振（SPR）檢測
通過使用自動SR7500DC系統（賴克特技術，迪皮尤，NY，USA）的SPR測定VRK1和木犀草素之間的相互作用的動力學參數進行了評價。用於製備VRK1共軛金晶片，VRK1被固定在CMDH晶片上（＃13206066），然後木犀草素，eupatilin和漢黃芩素物在指定濃度注入晶片的表面上，在10mM磷酸緩衝鹽水稀釋（PBS ）含有1％DMSO作為運行緩衝液。被scrubber2軟體（BioNavis，坦佩雷，皮爾卡，芬蘭）進行收集的數據分析。
配體對接試驗
從VRK1的X射線結構開發的同源性模型被用來評估分子相互作用和新鑑定VRK1的結合方式引出。在本研究中，模型結構是能量最小化在發現工作室3.0套件[34] 5000步的魅力力場和共軛梯度法。使用準備配體模塊和能量最小化使用在發現工作室3.0套件的智能算法極小步驟2000製備木犀草素的3-D坐標。分子對接程序GOLD 5.0被用來評估VRK1引線的結合模式。我們以前的核磁共振結合研究已經確定了是在配體結合攝動關鍵殘基;這些被用來定義的活性位點[34]。默認設置和評分功能，黃金PLP和黃金的計分函數，被雇用的得分對接互動和結合其可能的對接模式。
流式細胞儀分析
對於細胞周期分析，將HeLa細胞用GFP，GFP-VRK1，GFP-BAF染，然後用DMSO（載體）和10μM毛地黃黃酮處理。之後，將細胞固定，用70％乙醇含0.4％吐溫-20，用在PBS中的碘化丙啶染色。細胞周期和細胞的DNA內容物通過流式細胞術在FACSCalibur流式細胞儀（BD Biosciences公司，富蘭克林湖，新澤西州，美國）進行分析。數據採集用的細胞任務程序（BD Biosciences）上進行的。細胞凋亡分析，HeLa細胞用木犀草素以濃度依賴的方式處理，並用propodium碘和膜聯蛋白-V別藻藍蛋白雙重染色。細胞通過流式細胞儀分析。
免疫螢光染色
HeLa細胞用紅色螢光蛋白（RFP），RFP-VRK1，GFP和GFP-BAF使用微孔化轉染，然後用木犀草素10μM的處理24小時。接著，將細胞固定在4％多聚甲醛20分鐘，阻斷了10％FBS的PBS在室溫下1小時。細胞在PBS用Hoechst 33342染色在室溫下20分鐘，並使用共聚焦雷射掃描顯微鏡（Fluoview FV1000;奧林巴斯，東京，日本）觀看。 HeLa細胞用或不用木犀草素（10μM）處理24小時。接著，我們進行了其中被描述的詳細過程，然後將細胞染色用核纖層蛋白將B抗體，並使用Zeiss螢光顯微鏡（卡爾蔡司公司，德國Jena）或共焦雷射掃描顯微鏡觀察。
定量逆轉錄（RT）-PCR
使用TRI試劑（分子研究中心，辛辛那提，俄亥俄州，美國），根據製造商的說明，製備從HeLa細胞的總RNA，然後逆轉錄以產生互補DNA。定量RT-PCR使用了的SYBR Green PCR混合物（TakaraBio公司，滋賀縣，日本）和實時檢測系統（Applied Biosystems，福斯特城，CA USA）中進行。 GAPDH水平用於標準化的轉錄水平。
結果
木犀草素是VRK1激酶活性的有效抑制劑
審查木犀草素是否能有效地抑制VRK1的酶活性，我們進行了體外激酶測定和比較木犀草素與其他類黃酮類化合物的抑制效果。木犀草素顯著抑制BAF和組蛋白H3的VRK1介導的磷酸化的劑量依賴性。此外，VRK1的自磷酸化活性通過治療以劑量依賴的方式（圖1A和B）木犀草素衰減。雖然eupatilin和漢黃芩素，即顯示出結構相似木犀草素（圖1C）的類黃酮類的化學化合物，弱抑制VRK1激酶活性（圖1D和E），木犀草素顯示對BAF磷酸化和VRK1自動磷酸化最突出的抑制效果，暗示木犀草素的特異性。木犀草素對VRK1的特異性通過對BAF磷酸化和VRK1自動磷酸化（圖1F和G）其規格化抑制作用被進一步證實。這些結果表明，木犀草素是VRK1激酶活性，這是需要的細胞周期進展的調節的有效抑制劑。
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圖木犀草素對VRK1激酶活性1.抑制作用。
（A）和（B）中，在體外激酶活性測量為VRK1與BAF（A）或VRK1與組蛋白H3（B）中，通過增加木犀草素的濃度進行（0.0，1.0，10，50，100，和250μM） ，然後VRK1和基板的蛋白用硝酸銀染色。 （C）的化學結構和木犀草素，eupatilin，和漢黃芩素的分子量。 （D）和（E）的，具有BAF為VRK1體外激酶測定中，通過增加eupatilin（D）或漢黃芩素（E）的濃度（0.0，1.0，10，50，100，和250μM），然後VRK1進行和BAF蛋白用硝酸銀染色。 （F）和（G），VRK1自身磷酸化（F）或BAF磷酸化（G）的定量描述（B），（D）和（E）。在（F）和（G）的數據表示三次獨立實驗±中小企業的裝置。
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0109655.g001
木犀草素直接交互VRK1
因為木犀草素抑制VRK1的朝向其底物的作用，我們推測，木犀草素可能通過直接結合VRK1抑制激酶活性。調查木犀草素，VRK1之間的相互作用，我們進行了使用木犀草素綴合的瓊脂糖珠的下拉測定法。 GST無法綁定要麼木犀草素偶聯的瓊脂糖珠或控制珠。然而，GST-VRK1成功綁定到木犀草素綴合的瓊脂糖珠，但不結合，以控制未綴合木犀草素珠（圖2A）。我們接下來進行用的SH-SY5Y細胞裂解物下拉測定法來檢查木犀草素是否結合至內源性VRK1除了重組VRK1（圖2B）。內源性VRK1也可以結合木犀草素綴合的瓊脂糖珠。這些結果表明，木犀草素直接在體外用VRK1相互作用。
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圖2. VRK1木犀草素的直接互動。
（A）中，使用木犀草素綴合的瓊脂糖4B珠或對照瓊脂糖4B珠用重組VRK1蛋白下拉測定法。純化GST和GST-VRK1蛋白孵育指定的珠子，然後往下拉法進行。每個蛋白質通過用GST抗體進行免疫印跡檢測到。 （B）中，使用木犀草素綴合瓊脂糖4B珠的SH-SY5Y細胞裂解物下拉測定法。細胞裂解物與指定的珠子，然後下拉進行。蛋白質通過用VRK1抗體進行免疫印跡檢測到。 （C）中，SPR檢測木犀草素與VRK1的相互作用。該數據通過用分析物依次注入動力學滴定方法，無需再生步驟獲得。用傳統方法得到的eupatilin和漢黃芩素的數據。
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0109655.g002
使用表面等離子體共振（SPR）來監視結合動力學進一步分析木犀草素，VRK1之間的直接相互作用。重組VRK1蛋白質共價固定的傳感器晶片作為配位體上;隨後，木犀草素，eupatilin和漢黃芩素以濃度依賴的方式作為分析物（圖2C）中的溶液。由軟體VRK1塗覆傳感器晶片與這些分析物之間的相互作用的動力學參數進行評價，在表中表示1計算這些分析物朝VRK1展覽的常量木犀草素具有其中最強烈的結合親和力。兩者合計，這些結果表明，木犀草素直接結合VRK1具有高結合親和力。
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表1.木犀草素對VRK1結合的動力學參數。
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0109655.t001
木犀草素的抑制作用是通過其直接結合介導VRK1的催化結構域
為了確定VRK1的結合區為木犀草素，木犀草素，VRK1之間的相互作用通過NMR滴定實驗和在矽片建模評估。受木犀草素相互作用的胺基酸殘基顯示出顯著提高的化學位移擾動（圖3A）。這些殘基在化學位移擾動的頻譜表示，並且還分配VRK1（圖3B）的分子在地圖上，這表明這些殘基主要位於催化結構域的附近，這是參與ATP結合[34]。
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圖3. NMR滴定試驗，並與VRK1木犀草素的互動矽片建模。
（A），進行核磁共振滴定實驗。木犀草素結合後的化學位移擾動兌VRK1蛋白質的胺基酸殘基譜。 （B），對VRK1蛋白質化學位移擾動的映射。大部分的擾動殘基（以紅色顯示）都位於靠近VRK1的催化結構域。 （C）中，在木犀草素對VRK1蛋白質的結合模式的計算機晶片上建模。木犀草素被預測為適合在G環路，催化位點，α-C瓣附近。
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0109655.g003
在朝向VRK1木犀草素的結合模式的計算機晶片上建模，木犀草素被預測為適合在G環路，催化位點，α-C的葉（圖3C）的附近。上的色烯腳手架2-苯基的2，3-二羥基部分與α-C的波瓣的E83殘餘相互作用。另外，2位羥基也與催化循環的D197殘基相互作用。同樣，在色支架的4-酮基通過氫鍵相互作用與S181中相互作用。上的色烯支架7-羥基部分也使得氫鍵相互作用與從G環路的I43和Q45的殘基。除了這些氫鍵相互作用，色烯支架還具有與G環和周圍活性位點的疏水殘基的F48殘餘強層疊疏水性相互作用（未示出）。木犀草素具有其大部分與G環和催化位點的殘基鍵的相互作用，其木犀草素分子牢固地穩定到活性位點，並抑制其激酶活性的。
木犀草素通過BAF磷酸化的VRK1抑制誘導細胞周期阻滯
木犀草素先前已經證明，誘導細胞周期停滯在G1 / S和G2 / M期轉換[35] - [39]。然而，通過木犀草素的細胞周期停滯的分子機制是未知的，但不包括極光乙激酶可能是木犀草素，調節細胞周期進展的分子靶點的可能性，基於證據表明極光B由木犀草素抑制，發揮作用的有絲分裂的進展[40]一個關鍵的調解人。 VRK1是已公知的由諸如BAF，組蛋白H3幾個細胞周期相關底物的磷酸化進行在細胞周期進程協調角色另一個有絲分裂激酶和CREB [10] - [12]。因此，我們評估通過抑制VRK1木犀草素是否誘導細胞周期阻滯。用DMSO或木犀草素處理過的PI染色的細胞通過流式細胞儀分析，以評估細胞周期。在用木犀草素治療，在G1期人口顯著增加相比，在DMSO處理的細胞（圖4A，左面板）。與此相反，增加的G1期人口消失後GFP標記VRK1（圖4A，右面板）的過表達，表明木犀草素由VRK1的抑制導致細胞周期的早期階段停止。
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圖4.木犀草素誘導的細胞周期阻滯和核膜拆卸缺陷。
（A）中，細胞周期分析通過流式細胞術進行的。用GFP或GFP-VRK1轉染的HeLa細胞用木犀草素治療24小時後，10,000個細胞進行門控以供分析。定量數據低於直方圖。 （B）和（C）中，用媒介物或木犀草素與核纖層蛋白將B抗體進行染色處理的HeLa細胞可視化核膜和用Hoechst 33342對可視化的DNA。的Alexa 488染料綴合的抗體作為二次抗體。將載玻片用螢光顯微鏡（B），或共焦雷射掃描顯微鏡（C）的可視化。 （D）中，VRK1，BAF的螢光染色和DNA對BAF的磷酸化介導的重新定位的分析。細胞共轉染GFP或GFP-BAF與RFP或RFP-VRK1用DMSO或10μM的木犀草素處理24小時。
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0109655.g004
如上所述，VRK1參與BAF的磷酸化介導的重新定位於細胞質中，通過組蛋白H3磷酸化，並且CCND1表達染色質縮合CREB磷酸以促進細胞周期進展[10] - [12]。通過與VRK1活動木犀草素引起的干擾進一步解釋細胞周期阻滯的機制，我們評估是否木犀草素擾亂這些進程。因為它已經證明，VRK1增強CCND1的表達，這是與G1 / S期進展相關，通過增加在通過磷酸化CREB結合CCND1啟動子CRE元件的活性，我們推測，CREB磷酸和CCND1的mRNA水平可由木犀草素治療的影響。然而，有在CREB磷酸化和CCND1的DMSO和木犀草素治療（圖S1）之間的mRNA水平無顯著差異，這代表著木犀草素誘導的G1 / S逮捕可能已在其他進程，而不是抑制缺陷的後果CREB磷酸化。
我們測試了旁邊的曝氣生物濾池在G1 / S期阻滯引起的木犀草素可能參與。在果蠅和線蟲，它是公認的BAF具有基本作用在核結構和細胞周期進展[13]的組織，[41]。此外，燃油附加費的核定位影響人體細胞的細胞周期進程; VRK1，BAF的唯一識別上游激酶，可通過磷酸化改變BAF本地化從DNA和LEM-域蛋白如LAP2，emerin誘導BAF的釋放，並MAN1 [12]，[14]，[31]， [42]。 VRK1介導的BAF重新定位為G1 / S過渡過程中DNA釋放所必需的過程。以檢測由在細胞周期進展核膜動力學木犀任何擾動，我們染色與核纖層將B抗體核膜。拉明B從有絲分裂中染色質分離的，但是，BAF突變VRK1的損失或表達擾亂從網元[12]，[42]，[43]染色質分離。我們觀察到無論是核纖層B的沒有木犀草素處理進行分散。核纖層B的釋放入在晚後期細胞質中所示載體處理的細胞，而核纖層蛋白B被刺入在相同的相位的染色體中所示木犀草素處理的細胞（圖4B），這表明木犀草素誘導VRK1抑制會干擾VRK1介導的BAF磷酸化。
此外，我們還發現，木犀草素引起異常核膜形態如內陷和皰（圖4C），它是由VRK1的耗盡[44]誘導的現象。因此，我們建議，BAF磷酸的木犀草素介導的衰減可能會引起VRK1耗竭誘導異常核形態。為了證實木犀草素擾亂VRK1介導的BAF磷酸化，我們使用免疫印跡觀察到磷酸BAF水平。磷酸-BAF水平在10μM的木犀草素處理的細胞裂解物（圖S2）減少，表明VRK1催化活性通過木犀草素在體內降低。
先前的研究表明，BAF VRK1結果異位表達重新定位到細胞質[12]，[31]。因此，我們進一步研究BAF重新定位的現象是否影響VRK1的木犀草素介導的抑制。當兩個RFP-VRK1和GFP-BAF被一起引入，BAF似乎是分散在整個電池中，如先前已[31]報導。但是，我們證實了這種現象是由治療中斷木犀草素（圖4D）。 GFP-BAF的定位被限制在核質儘管VRK1過度表達，這表明木犀草素治療通過抑制VRK1有效降低BAF磷酸化，隨後的細胞周期停滯。審查BAF期間細胞周期的作用，我們木犀草素治療後，分析DNA含量。異位表達BAF不影響細胞周期進展（圖S3A）。在木犀草素施用，異位表達的BAF不能拯救木犀草素誘導的G1累積（圖S3B），表明木犀草素誘導G1期阻滯不導致由BAF抑制，但它通過抑制VRK1介導BAF磷酸化。
木犀草素誘導降低細胞活力和隨後的細胞凋亡
一旦通過結合VRK1的催化結構域介導的木犀草素的抑制效果被證實，我們評估了對腫瘤細胞增殖和存活的抗腫瘤作用。通過在不同濃度的MTT法測定對細胞活力木犀草素的影響。我們觀察到，木犀草素治療顯著相比減少了非致瘤性細胞系BEAS-2B和HEK293A（圖5A）的致瘤性細胞系HeLa和U2OS的生長。在HeLa和U2OS細胞的IC 50值確定為分別15.41μM和36.35微米，而那些在BEAS-2B和HEK293A細胞相比致瘤性細胞增多若干倍（分別為74.41微米和263.3微米）。這一結果表明，木犀草素對細胞增殖的抑制效果是在致瘤性細胞比非致瘤性細胞更為明顯，儘管在細胞系VRK1蛋白水平未與致腫瘤性（圖S4）相關。此外，木犀草素抑制HeLa細胞以時間依賴的方式（圖5B）的細胞活力。
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圖5.木犀草素具有選擇性殺傷腫瘤發生對細胞和誘導細胞凋亡。
（A），木犀草素對致瘤性（HeLa和U2OS）和非致瘤性（BEAS-2B和HEK293A）細胞系的細胞生存力的影響。細胞用24小時木犀草素的所示濃度處理。之後，細胞活力通過MTT測定法進行分析。 （B）中，對HeLa細胞存活木犀草素的時間依賴性影響。 HeLa細胞以標明的木犀草素10μM的對指示的時間進行處理。細胞活力通過MTT測定法評估。誤差棒代表平均值±SEM（N = 10）。符號（***）表示P值<0.0001。 （C）中，對A549細胞活力黃酮的效果進行比較。誤差棒代表平均值±SEM（N = 10）。符號（***）表示P值<0.0001。在（A）中的P值，（B）和（C）的使用學生t檢驗計算。 （D），木犀草素對HeLa細胞促凋亡作用。木犀草素的指定濃度處理HeLa細胞與PI /膜聯蛋白-V別藻藍蛋白進行雙重染色。通過流式細胞術進行細胞凋亡分析。
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0109655.g005
VRK1一直集中在對肺癌治療的合適靶標，因為VRK1是涉及在肺癌組織中的細胞周期和DNA損傷反應，而不是正常組織[45]。因此，我們測定木犀草素對A549肺癌細胞系的細胞毒性作用。在A549的IC 50是相似於這些在HeLa和U2OS細胞，並顯示出比eupatilin和漢黃芩素（圖5C）的腫瘤細胞的生長更明顯的效果。這些表明，類黃酮類化合物中，木犀草素對癌細胞的最具體的效果。
我們進一步研究了在木犀草素治療減少細胞增殖是否伴有凋亡的誘導。 PI /膜聯蛋白別藻藍蛋白雙重染色來分析木犀草素的促凋亡作用。在木犀草素施用，早期和晚期凋亡細胞的數目在一個濃度依賴性（圖5D）增加。
討論
無限增殖是腫瘤細胞的一個重要特點，而且是密切相關的不受控制的細胞周期。多項證據表明，有腫瘤的發展和細胞周期失調[46]之間的密切聯繫。對於抗癌治療至今，CDK家族和其它有絲分裂激酶已被視為有效的藥理學目標[1] - [3]。然而，因為它們不僅在致瘤性細胞，而且正常的細胞發揮關鍵作用，並且由於細胞周期進展也是正常細胞的關鍵過程中，這些激酶是不適於臨床試驗的藥物靶標[3]。另一方面，VRK1]是在正常細胞像其他的有絲分裂激酶表達的有絲分裂激酶，但它在某些腫瘤的生長顯著功能如肺癌和頭頸部鱗癌[8]，[45]。在有絲分裂的網絡的重新布線的研究，VRK1被認定為在肺癌細胞增殖的關鍵有絲分裂蛋白激酶。這代表著，VRK1是肺癌特異性有絲分裂網絡中的潛在成藥目標，因為它的基因表達的特異於所述癌症細胞周期的網絡和與細胞周期標記物[45]相關。此外，當VRK1被下調，它會導致G1期的細胞周期停滯和減少腫瘤細胞的增殖。這些結果是在本研究中（圖4和5）類似我們的觀察。有一些證據支持VRK1在腫瘤生物學中起重要作用。首先，有報導說，VRK1基因表達可以被選擇為在雌激素受體陽性乳腺癌[47]的發展顯著預後指標。此外，抑制VRK1介導的BAF磷酸化的小分子抑制劑obtusilactone乙誘導異常核膜動力學和腫瘤細胞死亡，與我們的發現相一致，即木犀草素介導的VRK1抑制導致類似現象[31]（圖4）。另一個早期研究表明VRK1是用於響應於DNA損傷53BP1病灶形成的上游激酶暗示特定VRK1抑制劑可能有助於額外的DNA損傷積累在腫瘤細胞中，從而導致腫瘤特異性的細胞死亡[23]。此外，幾個研究已經證明，VRK1耗盡能夠削弱腫瘤的增殖和轉移[48]。然而，VRK1抑制誘導的抗增殖作用於腫瘤細胞的分子機制仍然詳細地進一步描述開發一種新型的化療策略。
在最近的研究中，天然產物衍生的化合物進行了評價作為用於治療許多疾病的安全和有效的化學物質。特別是，已經證明，多酚類化合物，包括木犀草素，漢黃芩素，eupatilin和楊梅黃酮具有多個抗癌特性如抗增殖，抗轉移，抗血管生成和促凋亡效應[49] - [51 ]。儘管一些早期的研究發現，木犀草素削弱細胞周期進程或誘導腫瘤細胞的細胞周期阻滯，鮮為人知的是，在細胞周期失調木犀草素[35]詳細的分子機制 - [40]。有趣的是，在我們的研究，我們確定VRK1，在增殖細胞核心細胞周期調節，為木犀草素的直接分子靶向的合作夥伴，並進一步觀察。通過從VRK1活性的抑制木犀草素細胞增殖和細胞周期擾動的抑制。此外，木犀草素表現出與VRK1更具選擇性的相互作用相比其他類黃酮類化合物eupatilin和漢黃芩素（圖1和2）。一種可能的解釋是，在官能團的小差異可能賦予特異性和偏好朝向VRK1催化域即使這些化合物具有相同的類黃酮骨架結構。總之，我們的研究表明，木犀草素是有絲分裂激酶VRK1的小分子抑制劑，和誘導細胞周期停滯和優惠的細胞死亡的腫瘤細胞。因此，我們提供的證據支持的概念，即VRK1的分子靶向可能有助於替代抗癌化療戰略的發展。
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木犀草素不抑制VRK1介導的CREB磷酸和CCND1表達。 （A）磷酸化CREB水平和VRK1水平在指定濃度木犀草素治療後的改變是通過用所示抗體免疫印跡確定。拉明B用於裝載控制。 （B）的CCND1的相對mRNA水平中的所示濃度木犀草素處理後的變更通過定量實時PCR測定。 CCND1的mRNA水平由GAPDH mRNA的標準化。誤差棒指示的掃描電鏡。
圖S1。
木犀草素不抑制VRK1介導的CREB磷酸和CCND1表達。 （A）磷酸化CREB水平和VRK1水平在指定濃度木犀草素治療後的改變是通過用所示抗體免疫印跡確定。拉明B用於裝載控制。 （B）的CCND1的相對mRNA水平中的所示濃度木犀草素處理後的變更通過定量實時PCR測定。 CCND1的mRNA水平由GAPDH mRNA的標準化。誤差棒指示的掃描電鏡。
DOI：10.1371 / journal.pone.0109655.s001
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圖S2。
木犀草素擾亂體內VRK1介導的BAF磷酸化。 HeLa細胞以24小時增加木犀草素（0.0，1.0，2.0，5.0μM）的濃度進行處理。各蛋白質水平通過指定抗體探測。 GAPDH用作上樣對照。
DOI：10.1371 / journal.pone.0109655.s002
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圖S3。
異位表達BAF不影響細胞周期分布，並且不營救木犀草素誘導的G1期阻滯。 （A）HeLa細胞GFP或GFP-BAF轉，然後沾滿PI用於分析DNA含量。細胞周期分析通過流式細胞術進行的。 （B）GFP或GFP-BAF過度表達細胞用或不用10μM的木犀草素處理24小時，然後進行染色使用PI。通過流式細胞術進行細胞周期分析。
DOI：10.1371 / journal.pone.0109655.s003
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圖S4。
在各種細胞系（HeLa細胞，U2OS，SH-SY5Y，BEAS-2B，HEK293A，A549）VRK1和BAF和組蛋白H3的磷酸化的內源表達水平。每個蛋白質和其磷酸化水平是由當與各細胞提取物的20微克加載所示抗體免疫印跡檢測到。
DOI：10.1371 / journal.pone.0109655.s004
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作者投稿
構思和設計實驗：YSK SHK KYC KTK。進行的實驗：YSK SHK JS AH HNL JKL YSJ。分析數據：YSK JS AH HSY KTK。貢獻試劑/材料/分析工具：NIB。